实验小白鼠解剖器械的临床应用
来源：未知 |发布时间：2021-03-17 09:38|点击:次
sgRNA活性检测
将4 g质粒px458-sgRNA 用脂质体lipo3000转染至汇合度达到60%~80%的 N2A细胞,对照为转染 px458空载质粒(空白对照)，混匀，置于5%cO,、37℃孵箱中培养。转染72h后提取细胞DNA。弃除细胞培养基，加l mL PBS将细胞吹散，收于1.5 mL EP管中，12,000 r/min离心1 min，去上清,留沉淀。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。然后吸取2 uL DNA作为模板，引物为E3F和E3R，用KOD酶体系进行PCR扩增。扩增程序:95℃ 5 min; 94℃30 s.60℃ 30 s,68℃ 30 s.35个循环;68℃ 5 min。用纯化试剂盒纯化PCR产物,然后进行变性、复性，其程序为95℃ 5 min，在95℃降至85℃期间,以每秒2℃退温,在85℃降至25℃期间，以每秒0.1℃退温，最后产物于4℃放置10 min。按照Surveyor突变检测试剂盒,分别加人1 uL Surveyor Nuclcase S .。1 uL Surveyor Enhancers.0.15 mol/L MgClz2 uL和20 uL DNA,混匀后42℃放置1 h，加入1/10体积的终止液混匀后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。根据编辑效率公式feut =(b+c)(a+b+e)和 inde(%)=100×(1-( 1-feut))进行计算来评估CRISPR/Cas9的编辑效率。
1.5构建AAV-sgRNA-Cre载体及其Cre重组酶活性验证
AAV-Cre病毒表达载体(60229，使用SapI限制性内切酶酶切，37℃水浴l h，按照胶回收试剂盒说明书回收约6400 bp长度的DNA片段。将筛选出活性最高的 sgRNA退火后与酶切回收的AAV病毒表达载体片段连接，转化至DH5a感受态，挑取单克隆菌落并提取质粒进行测序,验证sgRNA序列重组到AAV-Cre载体上。
将重组后的AAV-Cre质粒和红色荧光蛋白报告基因质粒(AAV-double-floxed-mcherry)共转检测Cre重组酶活性。实验分成5组，分别为转染Cre-GFP质粒(阳性对照)。转染红色荧光蛋白报告基因质粒(报告质粒)、转染AAV-Cre质粒(实验组)、共转阳性对照和报告质粒以及共转实验组和报告质粒。转染前24 h，消化293T细胞铺板24孔板，每孔接种细胞1×103个。转染质粒总量为1 ug。转染试剂为Lipofectin 3000。转染后6h进行细胞换液,弃去培养盘中原有培养基，加入0.5 mL完全培养基。转染48 h后观察荧光,进行拍照。将重组后的AAV-Cre进行病毒包装、纯化和浓缩。
1.6立体定位法注射AAV-sgRNA-Cre病毒
LSL-Cas9-EGFP成年鼠随机分为GFP病毒注射组(CON组)和AAV-Cre病毒注射组(KO组)。用戊巴比妥钠60~80 mg/kg 腹腔注射麻醉成年小鼠。将小鼠两侧外耳道及牙齿固定在脑立体定向仪，常规备皮消毒后进行头部剪毛，剪去表层皮肤暴露前囱并标记前囱位置。根据坐标点调整好钻孔位置,确立右侧纹状体坐标:前凶后0.46 mm.中线侧旁开2.00 mm，硬膜下4.00 mm。调整游标卡尺对应其坐标点,用牙科钻孔器钻孔。用微量注射器进针,缓慢注射。注射速度0.2 uL/min，注射病毒量0.5~2.0 uL。注射完毕停10 min后缓慢退针、缝皮、消毒、解除固定。给予光照为小鼠保暖，等待小鼠苏醒。注射过程及结束后均需要观察动物的反应及有无死亡。注射后1月、2月时分别处死小鼠,进行全脑冰冻切片。注射6月后处死小鼠．提取注射部位的纹状体组织，留取标本。
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