啮齿类动物视网膜血管系统的发育
来源：未知 |发布时间：2018-11-09 12:37|点击:次
大部分非灵长类哺乳动物的视网膜血管是在出生后发生的。成年小鼠视网膜血管系统粗略地分为3层:位于神经节细胞内表面的浅层血管网,位于内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网。由于啮齿类动物视网膜脉管系统局限在二维空间中,且在出生后发生便于监测和操作,容易对血管网发生和形成进行观察,因此啮齿类动物视网膜脉管系统成为研究血管发育的较好的模式系统。在视网膜病的病理过程中,多数导致失明的疾病都是由于异常的眼内血管发生而造成。例如人类糖尿病性视网膜病,视网膜血管结构发生改变,视网膜水肿和出血,导致视力受损。因此,了解调制视网膜血管生长的机制可以为阐明病理性血管发生提供理论依据。本实验的目的是通过观察啮齿类动物视网膜血管和血视网膜屏障( blood- retinal barrier,BRB)发育的基本过程,为进一步研究病理性视网膜血管发生和视网膜疾病中的BRB受损的细胞分子机制提供依据。
材料和方法
1.实验动物
C57BL/6J小鼠和SD大鼠,雌雄不限,由河南省实验动物中心提供。常年室温在22-25℃、相对湿度60~70%环境下饲养。定期消毒,房间面积50m2按自然昼夜节律采光,自由进食和饮水。仔鼠出生当日计为P0( postnatal day0)。
2.视网膜整体铺片、切片制作及免疫组织化学染色视网膜铺片采用不同年龄组(P1、P3、P5、P7、P10、P14、P30)的小鼠各12只,切片采用不同年龄组的大鼠各6只。用1%戊巴比妥钠按20mg/kg体重腹腔注射麻醉后,用4%多聚甲醛( paraformaldehyde,PFA,0.1mol/LPB配置)经左心室进行灌流,取出眼球,剪去眼前节(角膜、晶状体),体视显微镜下小心剥离出视网膜。将视网膜剪成“+”字花形,放入4%PFA4℃固定2-3h。然后在0.01mol/LPBS(pH7.4)中漂洗3次,每次15min。用一抗4℃孵育2-3d。所用一抗分别为兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白( glial fibrillary acidicprotein,GFAP,1:200,北京中杉金桥生物技术有限公司)和兔抗鼠Ⅳ型胶原蛋白( Collagen,Col, 1:200,AB756P; Chemicon公司)。0.01mo/LPBS漂洗3次,每次15min。二抗 Alex Fluro568标记羊抗兔lgG(1:600, nitrogen公司)4℃孵育过夜。
0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min。将视网膜神经节细胞层向上平铺在干净的载玻片上,滴加封片剂,加盖盖玻片,指甲油封固四周,晾干后在荧光显微镜(BX61, Olympus)下观察摄片。制作切片时将固定好的视网膜依次浸泡在10%、20%、30%蔗糖溶液(0.1mol/LPB配置)中脱水至下沉,然后将视网膜平铺在干净的载玻片上,吸干周围多余的蔗糖溶液,滴加胶水于视网膜上,置于冷冻切片机的冷台上快速冷冻成固体状,修成规则型,用冷冻切片机切片,切片厚度为18μm,切片晾干后进行组织化学染色,封片摄片。
3.电镜标本的制作
选取P0、P3、P4、P304个年龄组的小鼠各6只。经腹腔注射1%戊巴比妥钠(20mg/kg)作全身麻醉,开胸后经左心室灌注4%PFA和戊二醛混合液(按4:1比例混合)至流出的液体变清。取出眼球,剥离出视网膜,用双面刀片垂直切开视网膜成2mm×2mm左右的组织块。4%戊二醛浸泡固定2~4h0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min
1%锇酸浸泡固定约1~2h。0.01mol/LPBS漂洗干净。再经系列丙酮梯度脱水,Epon812浸脂,树脂包埋,按37℃(3h)、45℃(6h)和63℃(24h))进行聚A~C.Ⅳ型胶原蛋白免疫染色(绿色)和DAPI复染(蓝色)的视网膜切片中的血管网:A.P9的视网膜切片上只有视网膜内表面的浅层血管网;B、C.P14至成年,浅层血管网(图B中1s)发出垂直分支(图B中箭)进入内核层内、外侧缘形成深层血管网(图B、C中2nd、3rd)。D-FP|4视网膜铺片中的血管网分层(Ⅳ型胶原蛋白免疫染色):D.视网膜内表面的浅层血管网(绿色);E.内核层外侧缘的深层血管网(红色);F.D和E人工合成图。G~L.明胶墨汁灌流显示P0视网膜铺片中的血管网分层:G.位于视网膜内表面的浅层血管网;H.位于内核层内侧缘的深层血管网;L.位于内核层外侧缘的深层血管网。D-1中箭示浅层血管网和深层血管网之间的连接枝。CCL为神经节细胞层,PL为内网层,NL为内核层,OPL为外网层,0NL为外核层。标尺示100μm图3GFAP抗体标记的生后不同年龄阶段小鼠视网膜中的星形胶质细胞
A、B.P1至P3,星形胶质细胞从视乳头部位(图A星号)发出,由中心向周边扩展,细胞突起之间形成网状或环状联系;C、D.P5至P7,星形胶质细胞继续向周边扩展,细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现“中空管样”结构,细胞突起末端缠在中空管样结构上;E~G、P10至成年,星形胶质细胞网覆盖整个视网膜,“中空管样”结构出现分支分级,细胞突起末端缠在管样结构上。A、D、G中白色框中部位为高倍图。A-G标尺示200μm;A、D和G白色框中图标尺示25μm图4光学显微镜下成年啮齿类动物血-视网膜屏障的结构
A.由明胶墨汁灌流显示的血管管腔和血管内皮;B.Ⅳ型胶原蛋白抗体染色的血管网的基膜成分;C.GFAP抗体染色的星形胶质细胞突起形成的中空管样结构即血管外表面的星形胶质细胞层。标尺示100μm膜中最先分化的细胞是在视网膜的中央,而较晚产生的细胞都是在视网膜的周围;最先产生的是神经节细胞,紧接着是水平细胞、视锥细胞和无长突细胞,在更晚时期是双极细胞、视杆细胞和 Muller细胞视网膜细胞分化成熟的先中心后周边、先浅层后深层的时空顺序与视网膜血管网先中心后周边、先形成浅层血管网(位于神经节细胞层)再形成深层血管网(位于内核层的内侧缘即无长突细胞所处位置和外侧缘即水平细胞所处位置)存在高度的一致性,这说明视网膜细胞的分化成熟可能与视网膜血管网提供的氧气和营养成分有关。另外,结果发现视网膜深层血管网的形成是在P14左右,这与啮齿类动物开眼时间一致,表明深层血管网的形成与视觉功能的成熟有相关性。
2.啮齿类动物BRB的发育
中枢神经系统的血管发育成熟也包括内皮细胞形成可通透性屏障,形成血脑屏障和BRB。在脑发育中,最早阶段的脑血管中就有阻止蛋白质和大分子物质的屏障存在21。在发育晚期,星形胶质细胞使血脑屏障进一步成熟,形成由内皮细胞、内皮细胞外基膜、星形胶质细胞终足和周细胞构成,在血管周围还有神经元和小胶质细胞存在的成熟血脑屏障,选择性通透血源性物质进入脑组织,在成年可以阻止低分子量物质通过,维持脑的内环境稳定。成熟的BRB由特化的视网膜微血管和包绕它的周细胞和星形胶质细胞终足组成我们采用3种不同的染色方法在光学显微镜下观察了成年啮齿类动物的BRB结构,并系统地用透射电镜观察了BRB的发生和形成过程。研究结果表明,成年脊椎动物的BRB由血管内皮细胞、基膜、图5超微结构水平显示小鼠血-视网膜屏障的发育
A、B.P3时,血视网膜屏障由单层内皮细胞、厚薄不均一的基膜和短而宽厚的不完全包绕血管的星形胶质细胞终足构成;C、D.P14的血视网膜屏障中单层内皮细胞间出现紧密连接,内皮细胞腔面有多个微绒毛,基膜和星形胶质细胞终足均较P3时更成熟;E-G.P30的血视网膜屏障完全成熟,内皮细胞腔面光滑、细胞间有紧密连接、胞质中有少量内吞泡,基膜均匀完整,星形胶质细胞终足包绕完全。
图B、D、F、G分别为图A、C、E白色方框部分的放大图。黑色箭示基膜,星号示星形胶质细胞终足,黑色箭示微绒毛,黑色粗箭示内皮细胞胞质中的内吞泡,白色箭示内皮细胞间的紧密连接。A标尺示3300mm;B标尺示660mm;C标尺示1700mm;D标尺示340m;E标尺示1000mm;F、G标尺示333mm周细胞和星形胶质细胞突起构成。微血管周围未发现小胶质细胞。BRB功能的完整性可以通过以下两种成分的存在来鉴定,一个是含有少量内吞泡的细胞之间存在紧密连接,另一个是调控离子和代谢产物浓度的构成屏障本身的分子16。本实验中透射电镜下视网膜血管超微结构显示,P14时,血管内皮细胞之间已存在紧密连接,内皮细胞腔面有少量微绒毛,说明内皮细胞代谢仍十分活跃,屏障功能仍在进一步发展;P30时,内皮细胞腔面光滑,胞质较薄的部位含有内吞泡,且细胞之间有紧密连接结构存在,满足上述第1个条件。另外,观察结果表明,在血-视网膜屏障形成的早期,微血管往往由多个星形胶质细胞伸出较短而厚的终足不完全包围,且血管基膜基质不均匀,厚度也不均一。至晚期,微血管由较长而薄的终足严密包绕,基膜基质均匀且厚度均一,形成成熟的BRB。与脾血窦内皮细胞之间存在较大间隙和不完整的基膜相比,BRB中多层的星形胶质细胞终足、基质均匀的完整基膜和紧密连接的内皮细胞在视网膜内形成了天然的屏障,选择性地阻断了血中有害物质进入视网膜组织内,有效地维持了视网膜内环境的稳定,维持视网膜神经元的功能,在眼睛内的抗感染中起重要作用。已有研究表明,无论是视网膜血管网的形成还是血-视网膜屏障的形成都离不开视网膜星形胶质细胞。星形胶质细胞和视网膜血管之间的关系已经确立3.1-2。事实上,只有含有血管化视网膜的物种才表达视网膜星形胶质细胞,而且在这些物种的视网膜中,星形胶质细胞只存在于血管化区域内23。我们的观察结果也发现,啮齿类动物视网膜上的星形胶质细胞是从视神经头部进入视网膜并在视网膜内表面迁移形成网状结构,血管网也从视乳头部位出现并在视网膜内表面迁移形成网状结构,与上述研究结果基本一致。综上所述,本实验建立了完整的生后啮齿类动物视网膜血管系统的发育模式,并进一步提供证据表明小鼠视网膜脉管系统发育与视网膜细胞的发育有关联,且与视网膜视觉功能的建立相关。血一视网膜屏障的发育成熟使视网膜具备一定的抗感染能力,维持视网膜内环境的稳定。2~4h0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min1%锇酸浸泡固定约1~2h。0.01mol/LPBS漂洗干净。再经系列丙酮梯度脱水,Epon812浸脂,树脂包埋,按37℃(3h)、45℃(6h)和63℃(24h))进行聚合,制成电镜标本。70nm超薄切片,常规醋酸双氧釉和枸橼酸铅染色,透射电子显微镜观察各组视网膜各层中毛细血管的超微结构。
4.明胶墨汁灌流展示成年小鼠视网膜各层血管网取2~3月成年小鼠12只,用1%戊巴比妥钠(20mg/kg)腹腔注射麻醉。开胸后先用4%PFA经左心室灌流至流出的液体变清,再用60℃的6.5%明胶墨汁灌流至全身变黑,然后经小鼠心脏根部结扎,放人-20℃冰盒冻存2h左右。取出眼球,剥离视网膜,剪成“+”字花形,平铺在干净的载玻片上,用0.01mol/LPBS封片,指甲油封固,晾干后在显微镜下观察视网膜各层血管网并摄片。结果光学显微镜下啮齿类动物视网膜血管系统的发育过程
1.1啮齿类动物视网膜血管网的发育过程:啮齿类动物的视网膜血管系统是在出生后由视乳头部位发出,并以视乳头为中心呈放射状蔓延生长,逐渐形成浅层血管网并最终覆盖整个视网膜。在此过程中,浅层血管网不断发生修建重塑,分化出血管主干、分支、动脉和静脉等,继而发出血管芽伸入视网膜内核层的内侧和外侧边缘形成两个平行于浅层血管网的深层血管网,且血管网的发育过程与星形胶质细胞有关。图1显示了光学显微镜下啮齿类视网膜浅层血管网的发育情况。用Ⅳ型胶原蛋白抗体标记生后不同年龄阶段的啮齿类视网膜,视网膜血管网的发育过程如下。P1时,视网膜血管从视乳头中心发出,呈放射状不对称生长(图1A)。P3时,血管以视乳头为中心在视网膜内表面继续向周边蔓延,形成辐射状且相对均匀的网状结构(图1B)。P5至P,血管网继续向周边蔓延并发生重塑形成非均一网络:周边部的血管网呈相对较均一和浓密的蜂房样结构,而中心区域的血管网却变得相对松散;血管直径出现明显差别,分化出血管主干和分支,血管主干周围发生重塑,分化出血管主干的初级分支,动、静脉显现,动脉主干周围出现无血管区(图1C,1D)。至P10时,视网膜浅层血管网已经到达视网膜边缘,并覆盖整个视网膜,且中央部位的浅层血管网已经发出血管芽向深层生长(图1E)。P10之后,视网膜浅层血管网进一步重塑,多余的小血管消失,血管网变得更疏松,血管分支分级更多。至P14时,视网膜浅层血管网与成年时视网膜浅层血管网形态分布和血管分支分级基本相同(图1F,1G),形成成熟的分级血管树。视网膜血管网的分层也是逐步形成的。图2显示了啮齿类动物视网膜血管网分层的形成过程。P的视网膜切片图中只有位于神经节细胞层的浅层血管网(图2A);P14至成年的视网膜切片图中浅层血管网已发出贯穿内网层和内核层的垂直分支(图2B中箭)并在内核层内、外侧缘形成平行于浅层血管网的两个深层血管网(图2B,2C)。P14至成年的视网膜铺片中也可观察到浅层血管网和两个深层血管网(图2D~21)及血管网之间的连接支(图2D-21中箭)。由此可知,深层血管网是在浅层血管网覆盖整个视网膜(约P9左右)之后形成的,P14时基本形成3个平行的血管网分层。
1.2啮齿类动物视网膜星形胶质细胞与血管网的发育:星形胶质细胞与视网膜血管网的发育密切相关。我们用GFAP抗体标记啮齿类动物视网膜星形胶质细胞,发现星形胶质细胞也是从视乳头部位开始生长,并在视网膜内表面蔓延生长,最终覆盖整个视网膜。细胞突起相互接触或缠绕形成网状结构和中空管样结构,类似与视网膜上的血管网。图3显示了生后不同年龄阶段的小鼠视网膜星形胶质细胞的分布。P1至P3,GFAP阳性细胞仅出现在视乳头和邻近周围区域,细胞呈细长流线型,多数只有两个突起,突起之间形成网状或环状联系(图3A,3B)。P5至P7,CFAP阳性细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现中空“管样”结构,细胞突起数目增多细胞外形由不典型的星状(有2~3个突起)变成典型的星状外形(有5-7个突起)(图3C,3D)。P10至成年,星形胶质细胞突起之间形成的网状联系由较稠密变得较疏松,中空“管腔”样结构也逐步出现分级分支(图3E~3G),在视网膜内表面形成类似血管网的脉络。
1.3成年啮齿类动物BRB的结构:为了观察BRB的组成,我们用了3种不同的染色方法显示视网膜血管。明胶墨汁灌流法可以将明胶墨汁灌注在血管腔内并黏附在血管内皮上,此法可有效显示血管腔及血管内皮(图4A);Ⅳ型胶原蛋白是由血管内皮细胞分泌的基底层的一部分3,用Ⅳ型胶原蛋白抗体染色可以有效显示血管的基膜层(图4B);GFAP为星形胶质细胞特异性的胶质丝,用GFAP抗体染色可以有效显示星形胶质细胞的形态及其分支的分布(图4C)。通过3种不同的染色方法我们发现,在光学显微镜下成年啮齿类动物BRB至少有内皮细胞、基膜和星形胶质细胞终足(图4)3个成分构成。与血-脑屏障的内皮细胞、基膜、周细胞和星形胶质细胞终足构成类似。
2.电子显微镜下啮齿类动物血-视网膜屏障的发育
不同年龄小鼠视网膜电镜标本结果显示BRB是在星形胶质细胞和血管壁细胞相互作用中逐步形成的:星形胶质细胞先形成支架,构成血管壁的内皮细胞和周细胞先后进入支架内部,内皮细胞之间形成紧密连接并分泌基质形成基膜成分,随后星形胶质细胞的突起变薄变扁形成终足包绕血管壁形成完整的BRB。
图5显示了生后不同年龄的小鼠BRB的发育情况。PO的小鼠视网膜各层均未观察到毛细血管。至P3,仅在视网膜内表面即神经纤维层发现有毛细血管,且这些毛细血管的管腔由单层内皮细胞围绕而成,管壁外基膜边界模糊且厚度不均一(图5A、5B黑色箭),基膜外侧可见多个星形胶质细胞的终足或突起不完全包围,且终足较厚(图5A、5B星号)。至P14,在小鼠视网膜神经纤维层、内网层、内核层及外网层均可观察到毛细血管。毛细血管管腔由单层内皮细胞围绕,内皮细胞的管腔面有多个微绒毛(图5C、5D黑色箭),内皮细胞之间出现紧密连接(5C、5D白色箭),内皮外侧的基膜边界和厚度较P3时清晰和均匀(图5C、5D黑色箭)。基膜外侧由较薄的星形胶质细胞终足或突起包绕(图5C、5D星号)。至P30时,在视网膜神经纤维层、内网层、内核层和外网层均可观察到毛细血管。此时的毛细血管的管壁完整,内皮细胞管腔面光滑,胞内有少量内吞泡(图5E、5F黑色粗箭),细胞之间有紧密连接(图5E、5G白色箭),基底膜厚度均一(图5E、5F中黑色箭),基质均匀,内皮细胞外有周细胞(图中未切到),再外侧有星形胶质细胞的薄层终足或突起完全包绕(图5E、5F星号),成熟的BRB形成
讨论
1.啮齿类动物视网膜血管系统的发育
大部分非灵长类哺乳动物的视网膜血管是在出生后发生的。小鼠出生后,从视神经头部出现一个血管网形成视网膜血管,新的血管网横跨视网膜内表面在神经纤维层蔓延,至成年啮齿类动物视网膜血管系统粗略地分为3层:位于神经节细胞内表面的浅层血管网,位于内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网3,主要为视网膜内侧部提供氧气和营养物质。本实验详细观察了啮齿类动物生后视网膜血管网的发育过程,结果发现,啮齿类动物视网膜血管网在出生后,由视乳头部位发出,在视网膜内表面蔓延生长形成浅层血管网。生后10d左右,浅层血管网覆盖整个视网膜,并开始向深层生长。在此过程中,视网膜浅层血管网覆盖面积由小变大,血管密度由大变小,均一的血管网逐渐分化出血管主干、多级分支,并能区分动、静脉。P14时,内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网形成。
本实验结果表明,视网膜血管网的发生和成熟与视网膜细胞的发生与分化在时间和空间上存在致性。放射性同位素标记研究表明,脊椎动物视网图1小鼠视网膜血管网的发育
A~G. CollagenⅣ免疫染色的小鼠视网膜血管网;A、B.P至P3,血管由视乳头(星号)部位发出,呈辐射状由中心向周边蔓延,形成较均一的血管网;C=E.P5至P10,血管网继续向周边生长覆盖整个视网膜,并分化出主干及分支、动脉(a)及静脉(v),静脉附近的小血管发出血管芽(箭头)向深层生长;F、G.P14至P30,血管网分支分级更多,形成成熟的分级血管树。动脉周围有无毛细血管区。标尺示200μm图2啮齿类动物视网膜血管网的分层。
材料和方法
1.实验动物
C57BL/6J小鼠和SD大鼠,雌雄不限,由河南省实验动物中心提供。常年室温在22-25℃、相对湿度60~70%环境下饲养。定期消毒,房间面积50m2按自然昼夜节律采光,自由进食和饮水。仔鼠出生当日计为P0( postnatal day0)。
2.视网膜整体铺片、切片制作及免疫组织化学染色视网膜铺片采用不同年龄组(P1、P3、P5、P7、P10、P14、P30)的小鼠各12只,切片采用不同年龄组的大鼠各6只。用1%戊巴比妥钠按20mg/kg体重腹腔注射麻醉后,用4%多聚甲醛( paraformaldehyde,PFA,0.1mol/LPB配置)经左心室进行灌流,取出眼球,剪去眼前节(角膜、晶状体),体视显微镜下小心剥离出视网膜。将视网膜剪成“+”字花形,放入4%PFA4℃固定2-3h。然后在0.01mol/LPBS(pH7.4)中漂洗3次,每次15min。用一抗4℃孵育2-3d。所用一抗分别为兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白( glial fibrillary acidicprotein,GFAP,1:200,北京中杉金桥生物技术有限公司)和兔抗鼠Ⅳ型胶原蛋白( Collagen,Col, 1:200,AB756P; Chemicon公司)。0.01mo/LPBS漂洗3次,每次15min。二抗 Alex Fluro568标记羊抗兔lgG(1:600, nitrogen公司)4℃孵育过夜。
0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min。将视网膜神经节细胞层向上平铺在干净的载玻片上,滴加封片剂,加盖盖玻片,指甲油封固四周,晾干后在荧光显微镜(BX61, Olympus)下观察摄片。制作切片时将固定好的视网膜依次浸泡在10%、20%、30%蔗糖溶液(0.1mol/LPB配置)中脱水至下沉,然后将视网膜平铺在干净的载玻片上,吸干周围多余的蔗糖溶液,滴加胶水于视网膜上,置于冷冻切片机的冷台上快速冷冻成固体状,修成规则型,用冷冻切片机切片,切片厚度为18μm,切片晾干后进行组织化学染色,封片摄片。
3.电镜标本的制作
选取P0、P3、P4、P304个年龄组的小鼠各6只。经腹腔注射1%戊巴比妥钠(20mg/kg)作全身麻醉,开胸后经左心室灌注4%PFA和戊二醛混合液(按4:1比例混合)至流出的液体变清。取出眼球,剥离出视网膜,用双面刀片垂直切开视网膜成2mm×2mm左右的组织块。4%戊二醛浸泡固定2~4h0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min
1%锇酸浸泡固定约1~2h。0.01mol/LPBS漂洗干净。再经系列丙酮梯度脱水,Epon812浸脂,树脂包埋,按37℃(3h)、45℃(6h)和63℃(24h))进行聚A~C.Ⅳ型胶原蛋白免疫染色(绿色)和DAPI复染(蓝色)的视网膜切片中的血管网:A.P9的视网膜切片上只有视网膜内表面的浅层血管网;B、C.P14至成年,浅层血管网(图B中1s)发出垂直分支(图B中箭)进入内核层内、外侧缘形成深层血管网(图B、C中2nd、3rd)。D-FP|4视网膜铺片中的血管网分层(Ⅳ型胶原蛋白免疫染色):D.视网膜内表面的浅层血管网(绿色);E.内核层外侧缘的深层血管网(红色);F.D和E人工合成图。G~L.明胶墨汁灌流显示P0视网膜铺片中的血管网分层:G.位于视网膜内表面的浅层血管网;H.位于内核层内侧缘的深层血管网;L.位于内核层外侧缘的深层血管网。D-1中箭示浅层血管网和深层血管网之间的连接枝。CCL为神经节细胞层,PL为内网层,NL为内核层,OPL为外网层,0NL为外核层。标尺示100μm图3GFAP抗体标记的生后不同年龄阶段小鼠视网膜中的星形胶质细胞
A、B.P1至P3,星形胶质细胞从视乳头部位(图A星号)发出,由中心向周边扩展,细胞突起之间形成网状或环状联系;C、D.P5至P7,星形胶质细胞继续向周边扩展,细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现“中空管样”结构,细胞突起末端缠在中空管样结构上;E~G、P10至成年,星形胶质细胞网覆盖整个视网膜,“中空管样”结构出现分支分级,细胞突起末端缠在管样结构上。A、D、G中白色框中部位为高倍图。A-G标尺示200μm;A、D和G白色框中图标尺示25μm图4光学显微镜下成年啮齿类动物血-视网膜屏障的结构
A.由明胶墨汁灌流显示的血管管腔和血管内皮;B.Ⅳ型胶原蛋白抗体染色的血管网的基膜成分;C.GFAP抗体染色的星形胶质细胞突起形成的中空管样结构即血管外表面的星形胶质细胞层。标尺示100μm膜中最先分化的细胞是在视网膜的中央,而较晚产生的细胞都是在视网膜的周围;最先产生的是神经节细胞,紧接着是水平细胞、视锥细胞和无长突细胞,在更晚时期是双极细胞、视杆细胞和 Muller细胞视网膜细胞分化成熟的先中心后周边、先浅层后深层的时空顺序与视网膜血管网先中心后周边、先形成浅层血管网(位于神经节细胞层)再形成深层血管网(位于内核层的内侧缘即无长突细胞所处位置和外侧缘即水平细胞所处位置)存在高度的一致性,这说明视网膜细胞的分化成熟可能与视网膜血管网提供的氧气和营养成分有关。另外,结果发现视网膜深层血管网的形成是在P14左右,这与啮齿类动物开眼时间一致,表明深层血管网的形成与视觉功能的成熟有相关性。
2.啮齿类动物BRB的发育
中枢神经系统的血管发育成熟也包括内皮细胞形成可通透性屏障,形成血脑屏障和BRB。在脑发育中,最早阶段的脑血管中就有阻止蛋白质和大分子物质的屏障存在21。在发育晚期,星形胶质细胞使血脑屏障进一步成熟,形成由内皮细胞、内皮细胞外基膜、星形胶质细胞终足和周细胞构成,在血管周围还有神经元和小胶质细胞存在的成熟血脑屏障,选择性通透血源性物质进入脑组织,在成年可以阻止低分子量物质通过,维持脑的内环境稳定。成熟的BRB由特化的视网膜微血管和包绕它的周细胞和星形胶质细胞终足组成我们采用3种不同的染色方法在光学显微镜下观察了成年啮齿类动物的BRB结构,并系统地用透射电镜观察了BRB的发生和形成过程。研究结果表明,成年脊椎动物的BRB由血管内皮细胞、基膜、图5超微结构水平显示小鼠血-视网膜屏障的发育
A、B.P3时,血视网膜屏障由单层内皮细胞、厚薄不均一的基膜和短而宽厚的不完全包绕血管的星形胶质细胞终足构成;C、D.P14的血视网膜屏障中单层内皮细胞间出现紧密连接,内皮细胞腔面有多个微绒毛,基膜和星形胶质细胞终足均较P3时更成熟;E-G.P30的血视网膜屏障完全成熟,内皮细胞腔面光滑、细胞间有紧密连接、胞质中有少量内吞泡,基膜均匀完整,星形胶质细胞终足包绕完全。
图B、D、F、G分别为图A、C、E白色方框部分的放大图。黑色箭示基膜,星号示星形胶质细胞终足,黑色箭示微绒毛,黑色粗箭示内皮细胞胞质中的内吞泡,白色箭示内皮细胞间的紧密连接。A标尺示3300mm;B标尺示660mm;C标尺示1700mm;D标尺示340m;E标尺示1000mm;F、G标尺示333mm周细胞和星形胶质细胞突起构成。微血管周围未发现小胶质细胞。BRB功能的完整性可以通过以下两种成分的存在来鉴定,一个是含有少量内吞泡的细胞之间存在紧密连接,另一个是调控离子和代谢产物浓度的构成屏障本身的分子16。本实验中透射电镜下视网膜血管超微结构显示,P14时,血管内皮细胞之间已存在紧密连接,内皮细胞腔面有少量微绒毛,说明内皮细胞代谢仍十分活跃,屏障功能仍在进一步发展;P30时,内皮细胞腔面光滑,胞质较薄的部位含有内吞泡,且细胞之间有紧密连接结构存在,满足上述第1个条件。另外,观察结果表明,在血-视网膜屏障形成的早期,微血管往往由多个星形胶质细胞伸出较短而厚的终足不完全包围,且血管基膜基质不均匀,厚度也不均一。至晚期,微血管由较长而薄的终足严密包绕,基膜基质均匀且厚度均一,形成成熟的BRB。与脾血窦内皮细胞之间存在较大间隙和不完整的基膜相比,BRB中多层的星形胶质细胞终足、基质均匀的完整基膜和紧密连接的内皮细胞在视网膜内形成了天然的屏障,选择性地阻断了血中有害物质进入视网膜组织内,有效地维持了视网膜内环境的稳定,维持视网膜神经元的功能,在眼睛内的抗感染中起重要作用。已有研究表明,无论是视网膜血管网的形成还是血-视网膜屏障的形成都离不开视网膜星形胶质细胞。星形胶质细胞和视网膜血管之间的关系已经确立3.1-2。事实上,只有含有血管化视网膜的物种才表达视网膜星形胶质细胞,而且在这些物种的视网膜中,星形胶质细胞只存在于血管化区域内23。我们的观察结果也发现,啮齿类动物视网膜上的星形胶质细胞是从视神经头部进入视网膜并在视网膜内表面迁移形成网状结构,血管网也从视乳头部位出现并在视网膜内表面迁移形成网状结构,与上述研究结果基本一致。综上所述,本实验建立了完整的生后啮齿类动物视网膜血管系统的发育模式,并进一步提供证据表明小鼠视网膜脉管系统发育与视网膜细胞的发育有关联,且与视网膜视觉功能的建立相关。血一视网膜屏障的发育成熟使视网膜具备一定的抗感染能力,维持视网膜内环境的稳定。2~4h0.0lmol/LPBS漂洗3次,每次15min1%锇酸浸泡固定约1~2h。0.01mol/LPBS漂洗干净。再经系列丙酮梯度脱水,Epon812浸脂,树脂包埋,按37℃(3h)、45℃(6h)和63℃(24h))进行聚合,制成电镜标本。70nm超薄切片,常规醋酸双氧釉和枸橼酸铅染色,透射电子显微镜观察各组视网膜各层中毛细血管的超微结构。
4.明胶墨汁灌流展示成年小鼠视网膜各层血管网取2~3月成年小鼠12只,用1%戊巴比妥钠(20mg/kg)腹腔注射麻醉。开胸后先用4%PFA经左心室灌流至流出的液体变清,再用60℃的6.5%明胶墨汁灌流至全身变黑,然后经小鼠心脏根部结扎,放人-20℃冰盒冻存2h左右。取出眼球,剥离视网膜,剪成“+”字花形,平铺在干净的载玻片上,用0.01mol/LPBS封片,指甲油封固,晾干后在显微镜下观察视网膜各层血管网并摄片。结果光学显微镜下啮齿类动物视网膜血管系统的发育过程
1.1啮齿类动物视网膜血管网的发育过程:啮齿类动物的视网膜血管系统是在出生后由视乳头部位发出,并以视乳头为中心呈放射状蔓延生长,逐渐形成浅层血管网并最终覆盖整个视网膜。在此过程中,浅层血管网不断发生修建重塑,分化出血管主干、分支、动脉和静脉等,继而发出血管芽伸入视网膜内核层的内侧和外侧边缘形成两个平行于浅层血管网的深层血管网,且血管网的发育过程与星形胶质细胞有关。图1显示了光学显微镜下啮齿类视网膜浅层血管网的发育情况。用Ⅳ型胶原蛋白抗体标记生后不同年龄阶段的啮齿类视网膜,视网膜血管网的发育过程如下。P1时,视网膜血管从视乳头中心发出,呈放射状不对称生长(图1A)。P3时,血管以视乳头为中心在视网膜内表面继续向周边蔓延,形成辐射状且相对均匀的网状结构(图1B)。P5至P,血管网继续向周边蔓延并发生重塑形成非均一网络:周边部的血管网呈相对较均一和浓密的蜂房样结构,而中心区域的血管网却变得相对松散;血管直径出现明显差别,分化出血管主干和分支,血管主干周围发生重塑,分化出血管主干的初级分支,动、静脉显现,动脉主干周围出现无血管区(图1C,1D)。至P10时,视网膜浅层血管网已经到达视网膜边缘,并覆盖整个视网膜,且中央部位的浅层血管网已经发出血管芽向深层生长(图1E)。P10之后,视网膜浅层血管网进一步重塑,多余的小血管消失,血管网变得更疏松,血管分支分级更多。至P14时,视网膜浅层血管网与成年时视网膜浅层血管网形态分布和血管分支分级基本相同(图1F,1G),形成成熟的分级血管树。视网膜血管网的分层也是逐步形成的。图2显示了啮齿类动物视网膜血管网分层的形成过程。P的视网膜切片图中只有位于神经节细胞层的浅层血管网(图2A);P14至成年的视网膜切片图中浅层血管网已发出贯穿内网层和内核层的垂直分支(图2B中箭)并在内核层内、外侧缘形成平行于浅层血管网的两个深层血管网(图2B,2C)。P14至成年的视网膜铺片中也可观察到浅层血管网和两个深层血管网(图2D~21)及血管网之间的连接支(图2D-21中箭)。由此可知,深层血管网是在浅层血管网覆盖整个视网膜(约P9左右)之后形成的,P14时基本形成3个平行的血管网分层。
1.2啮齿类动物视网膜星形胶质细胞与血管网的发育:星形胶质细胞与视网膜血管网的发育密切相关。我们用GFAP抗体标记啮齿类动物视网膜星形胶质细胞,发现星形胶质细胞也是从视乳头部位开始生长,并在视网膜内表面蔓延生长,最终覆盖整个视网膜。细胞突起相互接触或缠绕形成网状结构和中空管样结构,类似与视网膜上的血管网。图3显示了生后不同年龄阶段的小鼠视网膜星形胶质细胞的分布。P1至P3,GFAP阳性细胞仅出现在视乳头和邻近周围区域,细胞呈细长流线型,多数只有两个突起,突起之间形成网状或环状联系(图3A,3B)。P5至P7,CFAP阳性细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现中空“管样”结构,细胞突起数目增多细胞外形由不典型的星状(有2~3个突起)变成典型的星状外形(有5-7个突起)(图3C,3D)。P10至成年,星形胶质细胞突起之间形成的网状联系由较稠密变得较疏松,中空“管腔”样结构也逐步出现分级分支(图3E~3G),在视网膜内表面形成类似血管网的脉络。
1.3成年啮齿类动物BRB的结构:为了观察BRB的组成,我们用了3种不同的染色方法显示视网膜血管。明胶墨汁灌流法可以将明胶墨汁灌注在血管腔内并黏附在血管内皮上,此法可有效显示血管腔及血管内皮(图4A);Ⅳ型胶原蛋白是由血管内皮细胞分泌的基底层的一部分3,用Ⅳ型胶原蛋白抗体染色可以有效显示血管的基膜层(图4B);GFAP为星形胶质细胞特异性的胶质丝,用GFAP抗体染色可以有效显示星形胶质细胞的形态及其分支的分布(图4C)。通过3种不同的染色方法我们发现,在光学显微镜下成年啮齿类动物BRB至少有内皮细胞、基膜和星形胶质细胞终足(图4)3个成分构成。与血-脑屏障的内皮细胞、基膜、周细胞和星形胶质细胞终足构成类似。
2.电子显微镜下啮齿类动物血-视网膜屏障的发育
不同年龄小鼠视网膜电镜标本结果显示BRB是在星形胶质细胞和血管壁细胞相互作用中逐步形成的:星形胶质细胞先形成支架,构成血管壁的内皮细胞和周细胞先后进入支架内部,内皮细胞之间形成紧密连接并分泌基质形成基膜成分,随后星形胶质细胞的突起变薄变扁形成终足包绕血管壁形成完整的BRB。
图5显示了生后不同年龄的小鼠BRB的发育情况。PO的小鼠视网膜各层均未观察到毛细血管。至P3,仅在视网膜内表面即神经纤维层发现有毛细血管,且这些毛细血管的管腔由单层内皮细胞围绕而成,管壁外基膜边界模糊且厚度不均一(图5A、5B黑色箭),基膜外侧可见多个星形胶质细胞的终足或突起不完全包围,且终足较厚(图5A、5B星号)。至P14,在小鼠视网膜神经纤维层、内网层、内核层及外网层均可观察到毛细血管。毛细血管管腔由单层内皮细胞围绕,内皮细胞的管腔面有多个微绒毛(图5C、5D黑色箭),内皮细胞之间出现紧密连接(5C、5D白色箭),内皮外侧的基膜边界和厚度较P3时清晰和均匀(图5C、5D黑色箭)。基膜外侧由较薄的星形胶质细胞终足或突起包绕(图5C、5D星号)。至P30时,在视网膜神经纤维层、内网层、内核层和外网层均可观察到毛细血管。此时的毛细血管的管壁完整,内皮细胞管腔面光滑,胞内有少量内吞泡(图5E、5F黑色粗箭),细胞之间有紧密连接(图5E、5G白色箭),基底膜厚度均一(图5E、5F中黑色箭),基质均匀,内皮细胞外有周细胞(图中未切到),再外侧有星形胶质细胞的薄层终足或突起完全包绕(图5E、5F星号),成熟的BRB形成
讨论
1.啮齿类动物视网膜血管系统的发育
大部分非灵长类哺乳动物的视网膜血管是在出生后发生的。小鼠出生后,从视神经头部出现一个血管网形成视网膜血管,新的血管网横跨视网膜内表面在神经纤维层蔓延,至成年啮齿类动物视网膜血管系统粗略地分为3层:位于神经节细胞内表面的浅层血管网,位于内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网3,主要为视网膜内侧部提供氧气和营养物质。本实验详细观察了啮齿类动物生后视网膜血管网的发育过程,结果发现,啮齿类动物视网膜血管网在出生后,由视乳头部位发出,在视网膜内表面蔓延生长形成浅层血管网。生后10d左右,浅层血管网覆盖整个视网膜,并开始向深层生长。在此过程中,视网膜浅层血管网覆盖面积由小变大,血管密度由大变小,均一的血管网逐渐分化出血管主干、多级分支,并能区分动、静脉。P14时,内核层内侧缘和外侧缘的深层血管网形成。
本实验结果表明,视网膜血管网的发生和成熟与视网膜细胞的发生与分化在时间和空间上存在致性。放射性同位素标记研究表明,脊椎动物视网图1小鼠视网膜血管网的发育
A~G. CollagenⅣ免疫染色的小鼠视网膜血管网;A、B.P至P3,血管由视乳头(星号)部位发出,呈辐射状由中心向周边蔓延,形成较均一的血管网;C=E.P5至P10,血管网继续向周边生长覆盖整个视网膜,并分化出主干及分支、动脉(a)及静脉(v),静脉附近的小血管发出血管芽(箭头)向深层生长;F、G.P14至P30,血管网分支分级更多,形成成熟的分级血管树。动脉周围有无毛细血管区。标尺示200μm图2啮齿类动物视网膜血管网的分层。
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